^{_{深芬儀器非洲豬瘟檢測儀使用說明書}}

^{_{l 本試劑盒用于檢測血清非洲豬瘟（ASF）存在與否。}}

^{_{l 有效期：6個月}}

^{_{l 保存條件：2-8℃}}

^{_{l 本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷}}

^{_{檢測前準備工作：}}

^{_{1. 請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。}}

^{_{2. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現象；放置室溫，輕搖均勻，待結晶*溶解后再配置洗滌液。可將20ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液，未用完的放回4℃}}

^{_{3. 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。}}

^{_{實驗所需自備試驗器材：}}

^{_{1. 檢測儀（450nm）}}

^{_{2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL}}

^{_{3. 37℃恒溫箱或水浴鍋}}

^{_{4. 蒸餾水或去離子水}}

^{_{試劑盒組成：}}

^_備注：

^{_{1.（96T/48T）打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全。}}

^{_{實驗原理：}}

  ^{_{試劑盒采用雙抗一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被非洲豬瘟抗體的包被微孔中，依次加入標本、HRP標記的檢測抗原，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值），與CUT OFF值相比較，從而判定標本中非洲豬瘟（ASF）的存在與否。}}

^{_{樣本處理及要求：}}

^{_{1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。}}

^{_{2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。}}

^{_{3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。}}

^{_{4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。}}

^{_{6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.}}

^{_{7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。}}

^{_{注意事項：}}

^{_{1. 嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。}}

^{_{2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。}}

^{_{3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。}}

^{_{4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用。}}

^{_{5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。}}

^{_{6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。}}

^{_{7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。}}

^{_{8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。}}

^{_{9. 不能使用過期產品,不同批號組分不得混用。}}

^{_{10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。}}

^{_{操作步驟：}}

^{_{1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。}}

^{_{2.  設置陰、陽性對照孔和樣本孔，陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照各50μL；}}

^{_{3.  待測樣本孔加待測樣本10μL，樣本稀釋液40μL；}}

^{_{4.  隨后陰、陽性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗原100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。}}

^{_{5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。}}

^{_{6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光水浴鍋孵育15min。}}

^{_{7.  每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。}}

^_計算：

^{_{1.  試驗有效性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00；}}

      ^{_{陰性對照孔OD值平均值≤0.15。}}

^{_{2.  臨界值（Cut off）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15}}

^{_{3.  陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性}}

^{_{4.  陽性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off），樣品為陽性}}

^{_{深芬儀器非洲豬瘟檢測儀試劑盒性能：}}

^{_{1.  準確性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00；陰性對照孔OD值平均值≤0.15，說明試驗結果有效。}}

^{_{2.  特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。}}

^{_{3.  重復性：板內、板間變異系數均小于15%。}}

^{_{4.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。}}